Akvatični ekosistemi su konstantno izloženi multistres uslovima, jerna njih simultano deluju različiti tipovi pritisaka - od globalnihpromena, preko hidromorfoloških izmena vodnih tela do ...zagađenjaporeklom iz koncentrisanih i rasutih izvora. Efikasnost upravljačkihmera u cilju zaštite ili unapređenja statusa akvatičnih ekosistemazavise u velikoj meri od pouzdane procene rizika i precizneidentifikacije ključnih pritisaka, što u multistres uslovima nijejednostavno. Regulatorno uslovljeni monitoring programi imaju za ciljpre svega procenu hemijskog i ekološkog statusa (potencijala) vodnihtela. Međutim, dugogodišnja iskustva pokazuju da po pravilu, ocenestatusa na osnovu ova dva ključna kriterijuma nisu saglasne, pa je teškoustanoviti jasne uzročno – posledične veze između zagađenja hazardnimsupstancama i promena na nivou akvatičnih životnih zajednica. Jednaod mogućnosti za prevazilaženje ovog problema je primenabioanalitičkih (mahom in vitro) metoda i biomarkera (kod eksponiranihjedinki i populacija) u retrospektivnoj proceni rizika kao sponeizmeđu hemijskog i biološkog monitoringa. Biomarkeri kao ranipokazatelji prisustva i / ili efekata hemijskog stresa mogu doprinetiidentifikaciji prioritenih lokacija, hazardnih supstanci i njihovihsmeša i povezati izloženost određenim klasama polutanata ilinjihovim smešama u životnoj sredini, sa efektima uočenim na višimnivoima biološke organizacije. Odabir optimalne baterijekomplementarnih opštih i specifičnih ekosistemski relevantnihbiomarkera, različitih nivoa biološke organizacije, od molekularnihdo fizioloških, primenljivih u različitim prostorno-vremenskimokvirima, i dalje predstavlja istraživački izazov i stoga je i predmetistraživanja ove doktorske disertacije. Opšti cilj istraživanja je bioodabir, optimizacija i integracija baterije fizioloških, enzimskih imolekularnih biomarkera kod riba, kao ključnog segmenta kompleksnogmultiparametarskog dijagnostičkog pristupa za identifikacijuhemijskog stresa koji predstavlja značajan pritisak na akvatičneekosisteme u realnim multistres uslovima. Specifični ciljevi suvezani za zadatke dve studije slučaja u okviru kojih je istraživanjesprovedeno. U okviru studije slučaja Novi Sad procenjeno je da jetoksični pritisak na odabranim lokalitetima nizak, ali ipak viši ugradskoj zoni Novog Sada u odnosu na uzvodne lokalitete. Na osnovuefekata uzoraka vode sa istih lokaliteta in vitro pERK1/2 esej se pokazaokao potencijalno koristan alat za monitoring efekta zagađenja uakvatičnim ekosistemima, zadovoljavajuće osetljivosti, kojom je mogućetektovati odgovor pri tretmanu kompleksnim uzorcima iz životnesredine koji sadrže jedinjenja koja utiču na ERK1/2 signalni put.Ograničenje ove metode, kao samostalnog alata predstavlja je niskaspecifičnost ERK1/2 signalnog puta na koji može uticati veliki brojsupstanci sa različitim načinima delovanja, pa se njegov potencijalogleda u primeni sa komplementarnim metodama u okviru kompleksnihbaterija in vitro bioeseja. Studija slučaja Novi Sad je u fokusu imala iunapređenje terenskih protokola i eksperimentalnih postavki kojiomogućavaju primenu biomarkera na različitim prostorno-vremenskimskalama u istražnim monitoring programima sa akcentom na velike reke,a koji podrazumevaju kavezni sistem izlaganja jedinki riba i procenuefekata hemijskog stresa kod jedinki iz prirodnih populacija.Primenom kavezne postavke izlaganja jedinki C. carpio je potvrđeno da jeza upotrebu biometrijskih parametara kao biomarkera potrebno duževreme izlaganja, dok su najosetljiviji parametri bili aktivnost enzimakatalaza, parametri imunog odgovora i autofagije kao i biomarkerineurotoksičnosti, među kojima se posebno istakao gen za bazni proteinmijelina. Zajedno sa detektovanim supstancama u serumu i mišićnomtkivu jedinki, odgovori biomarkera neurotoksičnosti su ukazali nazastupljenost ove grupe polutanata na analiziranim lokalitetima.Rezultati analize biomarkera kod jedinki riba iz prirodnih populacijaističu značaj novoidentifikovanih uloga različitih gena i proteinakoji su uobičajeno smatrani biomarkerima efekta, pokazujući da promeneu ovim parametrima ne moraju nužno ukazivati na pogoršanje zdravljajedinki riba, već bi se trebale tumačiti kao adaptivni odgovor nahemijski stres, pre nego direktan dokaz ekološkog uticaja zagađenja ine slučaja na široj prostornoj skali-tok reke Dunavizvršena je analiza efekata polutanata u prirodnim populacijama Alburnus alburnus, pri čemu nisu uočene razlike između analiziranihlokaliteta usled prirodne varijabilnosti i male veličine uzorka, kao inedostatka adekvatnog referalnog lokaliteta.
Organophosphorus insecticides have been the most applied group of insectcides for the last two decades. Their main toxic effects are related to irreversible inactivation of acetylcholinesterase ...(AChE). Actually, they covalently bind to serine OH group in the enzyme active site forming phosphorylated enzyme that cannot hydrolyze acetylcholine. Organophosphorus insecticides in the environment undergo the natural degradation pathway including mainly homogeneous and heterogeneous hydrolysis (especially at high pH) generating non-inhibiting products. Additionally, thio organophosphates are easily oxidized by naturally present oxidants and UV light, forming more toxic and stable oxons. Thus, oxidative degradation procedures, generally referred as advanced oxidation processes (AOP), have been applied for their efficient removal from contaminated waters. The most applied bioassays to monitor the organophosphate toxicity, i.e., the detoxification degree during AOP are Vibrio fischeri and AChE bioassays. Vibrio fischeri toxicity test exploits bioluminescence as the measure of luciferase activity of this marine bacterium, whereas AChE bioassay is based on AChE activity inhibition. Both bioanalytical techniques are rapid (several minutes), simple, sensitive and reproducible. Vibrio fischeri test seems to be a versatile indicator of toxic compounds generated in AOP for organophosphorus insecticides degradation. However, detection of neurotoxic AChE inhibitors, which can be formed inh AOP of some organophosphates, requires AChE bioassays. Therefore, AChE toxicity test is more appropriate for monitoring the degradation processes of thio organophosphates, because more toxic oxo organophosphates might be formed and overlooked by Vibrio fischeri bioluminescence inhibition. In addition, during organophosphates removal by AOP, compounds with strong genotoxic potential may be formed, which cannot be detected by standard toxicity tests. For this reason, determination of incidence of micronuclei and cell proliferation index in cultivated human lymphocytes and fibroblasts is suitable for evaluation of organophosphorus insecticides and their break down products inducing cytogenetic damage. Keywords: Organophosphorus insecticides * Acetylcholinesterase * Degradation * Advanced oxidation processes * Bioassays * Toxicity * Genotoxicity U ovoj studiji je dat pregled bioanalitickih tehnika za procenu toksicnosti i detekciju organofosfatnih insekticida i proizvoda njihove degradacije koji nastaju tokom unaprecenih procesa oksidacije za uklanjanje insekticida iz vode. Posebna paznja je posvecena acetilholinesteraznim bioesejima, koji se zasnivaju na inhibiciji enzimske aktivnosti, za detekciju neurotoksicnih jedinjenja formiranih tokom degradacije organofosfata u oksidacionim procesima za preciscavanje voda, kao i testiranju genotoksicnosti organofosfatnih insekticida i proizvoda njihove transformacije. Opisan je i mehanizam toksicnog delovanja organofosfatnih jedinjenja kao specificnih inhibitora acetilholinesteraze, enzima koji katalizuje hidrolizu neurotransmitera acetilholina u holinergickim sinapsama. Kljucne reci: organofosfatni insekticidi, acetilholinesteraza, degradacija, unapreceni procesi oksidacije, bioeseji, toksicnost, genotoksicnost. Dostupno na Internetu sa adrese ?asopisa:
Organophosphorus insecticides have been the most applied group of insecticides for the last two decades. Their main toxic effects are related to irreversible inactivation of acetylcholinesterase ...(AChE). Actually, they covalently bind to serine OH group in the enzyme active site forming phosphorylated enzyme that cannot hydrolyze acetylcholine. Organophosphorus insecticides in the environment undergo the natural degradation pathway including mainly homogeneous and heterogeneous hydrolysis (especially at high pH) generating non-inhibiting products. Additionally, thio organophosphates are easily oxidized by naturally present oxidants and UV light, forming more toxic and stable oxons. Thus, oxidative degradation procedures, generally referred as advanced oxidation processes (AOP), have been applied for their efficient removal from contaminated waters. The most applied bioassays to monitor the organophosphate toxicity i.e. the detoxification degree during AOP are Vibrio fischeri and AChE bioassays. Vibrio fischeri toxicity test exploits bioluminescence as the measure of luciferase activity of this marine bacterium, whereas AChE bioassay is based on AChE activity inhibition. Both bioanalytical techniques are rapid (several minutes), simple, sensitive and reproducible. Vibrio fischeri test seems to be a versatile indicator of toxic compounds generated in AOP for organophosphorus insecticides degradation. However, detection of neurotoxic AChE inhibitors, which can be formed in AOP of some organophosphates, requires AChE bioassays. Therefore, AChE toxicity test is more appropriate for monitoring the degradation processes of thio organophosphates, because more toxic oxo organophosphates might be formed and overlooked by Vibrio fischeri bioluminescence inhibition. In addition, during organophosphates removal by AOP, compounds with strong genotoxic potential may be formed, which cannot be detected by standard toxicity tests. For this reason, determination of incidence of micronuclei and cell proliferation index in cultivated human lymphocytes and fibroblasts is suitable for evaluation of organophosphorus insecticides and their break down products inducing cytogenetic damage.
Kao jedna od najstarijih grupa fotoautotrofnih mikroorganizama, cijanobakterije predstavljaju široko rasprostranjene prokariote sa raznovrsnim metaboličkim strategijama u cilju preživljavanja i ...adaptacije na različite uslove životne sredine. Upravo zbog toga, cijanobakterije su značajne kao producenti različitih biološki aktivnih metabolita. Međutim, većina studija o cijanobakterijama uglavnom je vezana za cijanobakterije vodenih ekosistema. Predmet istraživanja ovog rada je utvrđivanje diverziteta autohtonih cijanobakterija šumskih ekosistema i karakterizacija odabranih terestričnih cijanobakterijskih predstavnika planinskih područja Srbije izolovanih tokom trogodišnjeg monitoringa kroz utvrđivanje njihovih osnovnih ekofizioloških, biohemijskih i genetičkih karakteristika. Rezultati dobijeni u ovom radu su ukazali na diverzitet zemljišnih cijanobakterija šumskih staništa ispitivanih planinskih područja kao i na njihov metabolički diverzitet, odnosno potencijal produkcije različitih bioaktivnih jedinjenja. Na osnovu taksonomski važnih odlikaidentifikovano je i okarakterisano 20 cijanobakterijskih sojeva za koje je utvrđeno da pripadaju sledećim rodovima:Nostoc, Anabaena, Tolypothrix, Calothrix, Cylindrospermum, Lyngbya, Oscillatoria, Phormidium. Identifikacija izolovanih cijanobakterija primenom molekularanog markera 16S rRNK u većini slučajeva (90%) je potvrdila preliminarnu identifikaciju rodova na osnovu morfoloških kriterijuma. U pogledu produkcije biomase dobijeni rezultati su pokazali da jeprodukcija biomase kod odabranih testiranih cijanobakterijskih sojeva zavisila od primenjenih uslova kultivacije. Utvrđeno je da su azot, glukoza i saharoza delovali u pravcu stimulacije produkcije biomase kod velikog broja sojeva. Najveća produkcija biomase detektovana je kod sojaCalothrixM2 u prisustvu azota u medijumu. Kod sojaNostocT18 zabeleženo je najveće povećanje produkcije biomase u prisustvu glukoze i saharoze u medijumu. Takođe, sadržaj fikobiliproteina bio je povećan kod većine testiranih sojeva u prisustvu glukoze i saharoze u medijumu. Ispitivanjem sadržaja ugljenih hidrata (glukoze, fruktoze i ksiloze) konstatovano je prisustvo sva tri monosaharida kod svih sojeva pri čemu je svaki soj imao specifičan ugljeno-hidratni profil. Sadržaj monosaharida kod svih testiranih sojeva opadao je u sledećem redosledu glukoza ˃fruktoza ˃ ksiloza. Izuzetnu sposobnost produkcije heksoza i pentoza ispoljila su tri sojaNostocM1, PhormidiumT11 iCalothrixM2. Antibakterijska aktivnost intracelularnih ekstrakata registrovana je kod 16 testiranihcijanobakterijskih sojeva i zavisila je od kombinacije cijanobakterijski-bakterijski soj i tipa primenjenog ekstrakta. U odnosu na heksanske ekstrakte, metanolni ekstrakti su pokazali veću efikasnost, ukazujući na prirodu bioaktivnih jedinjenja sa antibakterijskim delovanjem. Najefikasnijim su se pokazali 75% MeOH ekstrakti cijanobakterijskih sojevaOscillatoriaM2, Calothrix M2,LyngbyaT7 iCylindrospermumK1 koji su ispoljili antibakterijsku aktivnost na 4 testirane bakterije. Hemijskom analizom masno kiselinskog sastava utvrđeno je da je masno kiselinski sadržaj cijanobakterijskih sojeva varirao u zavisnosti od soja. Najznačajniji konstituenti testiranih cijanobakterijskih sojeva bile su 18-to i 16-to ugljenične masne kiseline poput linolne kiseline i α-linoleinske. Najveći sadržaj linolne kiseline detektovan je kod sojeva Phormidium T11 i Tolypothrix K11 što ukazuje na sojeve kao potencijalno značajne izvore esencijalnih masnih kiselina. Antiradikalska aktivnost detektovana je kod svih testiranih cijanobakterijskih sojeva. U DPPH eseju, etanolni ekstrakti soja Calothrix M2 ispoljili su najefikasniju sposobnost „hvatanja“ DPPH·radikala dok je u slučaju FRAP metode najveću redukujuću moć imao etanolni ekstrakt soj Cylindrospermum K1. Hemijskom analizom fenolnog sastava kod analiziranih cijanobakterijskih sojeva identifikovano je i kvantifikovano ukupno 21 fenolno jedinjenje. Fenolni sastav je varirao u zavisnosti od soja, a najčešće detektovana fenolna jedinjenja bila su luteolin-7-O-glukozid, bajkalin i kemferol. Soj sa najznačajnijom sposobnošću produkcije fenolnih jedinjenja bio jePhormidiumM1 kod koga je identifikovano prisustvo 11 fenolnih jedinjenja. Testirajem toksičnosti intracelularnih ekstrakata u biotestovima A. salina, D. magna i D. rerio ukupno 40% testiranih sojeva ispoljilo je toksičan efekat. Najtoksičnijim sojem se pokazao sojNostoc T7 koji je ispoljio toksičnost u sva tri testa. U slučaju biotestaA. salinanajtoksičnijim sojevima pokazali su seNostocT7,OscillatoriaM2, OscillatoriaT18 iNostocK15. Cijanobakterijski sojevi koji su ispoljili najpotentniju aktivnost u biotestuD. magna bili su Tolypothrix K15, Nostoc T7 i Calothrix M2. U biotestu sa embrionima zebrica, soj sa najznačajnijim teratogenim efektom bio je CylindrospermumK1. U pogledu uticaja ekstrakta testiranog soja na ekspresiju gena kod model organizmaD. rerio,CylindrospermumK1 je ispoljio sposobnost modulacije bioloških procesa poput cirkadijalnog ritma kao i sposobnost produkcije jedinjenja sa estrogenim efektom. Rezultati analize toksigeničnosti testiranih cijanobakterijskih sojeva su pokazali da genimcyBimcyEkoji su uključeni u produkciju cijanotoksina mikrocistina nisu detektovani ni u jednom od testiranih sojeva. Odsustvo dva gena iz mcy genskog klastera ukazuje na to da su druga jedinjenja odgovorna za uočen toksični efekat u primenjenim biotestovima. Dobijeni rezultati ukazuju na značaj ispitivanja zemljišnih cijanobakterija, s obzirom na to da su rezultati ovog rada ukazali na velik metabolički diverzitet ispitivanih sojeva i izražen potencijal produkcije različitih bioaktivnih jedinjenja.
PDF
