Tiopurin S-metiltransferaza (TPMT; EC 2.1.1.67) je jedan od najboÿih primera primene
farmakogenetike u individualizaciji terapije. TPMT je enzim koji metabolise imunosupersivne
tiopurinske lekove ...(6-MP), koji se koriste u lečenju kancera, autoimunih bolesti i u
transpalntacionoj medicini. Aktivnost TPMT enzima je polimorfna i u beloj populacÿi je
zabeležena trimodalna distibucija TPMT aktivnosti: postoje jjudi koji su slabi, umereni ili jaki
„metilatori". Ipak, ne postoji jasna granica u aktivnosti TPMT izmedu ovih definisanih grupa.
Pokazano je da određeni polimorfizmi u genu za TPMT utiču na aktivnost TPMT enzima.
Promotor gena za TPMT čoveka je veoma polimorfan. Sadrži promenÿiv broj tandemskih
ponovaka, od tri do devet, koji imaju veliki procenat GC baznih parova. Postoje tri tipa
ponovaka, A, B i C. Arhitektura ovog promotorskog regionaje uvek AnBmC.
U ovom radu smo ispitivali da li genotipizacija polimorfizama u genu za TPMT može biti
osnova za modifikaciju tiopurinske terapije u lečenju akutne limfoidne leukemije (ALL) kod
dece. Takode smo analizirali distribuciju alela i genotipova VNTR ponovaka promotora gena
za TPMT u srpskoj populacÿi. Istraživali smo uticaj broja i tipa tandemskih ponovaka u
promotoru na transkripcÿu gena za TPMT čoveka, koristeći eksperimente tranzÿentne
transfekcÿe. Ispitivali smo i koji se transkripcioni faktori vezuju za VNTR region esejima
usporene elektroforetske pokretÿivosti (EMSA) i „superšift" esejima, analizirali metilacioni
status promotora, cis-regulatorne elemente u promotorskom regionu i ispitivali potencijalni
uticaj 6-MP na transkripcÿu gena za TPMT.
Nasa studÿaje pokazala da je genotipizacÿa TPMT neophodna i efikasna i da je osnova za
modifikaciju tiopurinske terapÿe kod ALL pacÿenata, čak i kod heterozigotnih nosilaca
polimorfizama u genu za TPMT.
Detektovali smo 11 različitih tipova VNTR u promotoru gena za TPMT u srpskoj populacÿi.
Broj ponovaka je bio od 4 do 8. Unutar promotora gena za TPMT sa istim brojem ponovaka,
detektovana je različita arhitektura VNTR regiona, AnBmC, gde je n = 1-5 i m = 1-6.
Detektovali smo 17 različitih TPMT VNTR genotipova u srpskoj populacÿi. Funkcionalni eseji
su pokazali da najveću aktivnost TPMT promotora ima onaj sa VNTR*4b tipom (AB2C).
Promotori sa 5, 6 i 7 VNTR alela su imali manje aktivnosti. Aktivnost VNTR*8 alela je bila dva
puta veća od aktivnosti VNTR*7 tipova. Utvrdili smo da postoje razlike u aktivnostima
promotora između konstrukata koji su imali isti broj ali različiti tip tandemskih ponovaka.
Najveća razlika detektovana je između VNTR*4 varijanti (A2BC i AB2C). Takođeje nadeno da
je promotorski region uzvodno od VNTR ponovaka, na poziciji od -180 do -130,
transkripcioni aktivator.
Potvrdili smo da se za VNTR region direktno vezuju transkripcioni faktori Spl i Sp3.
Promotor gena za TPMTje specifično odgovorio na tretman ćelija dozom od 10 pM 6-MP, i
to na VNTR-zavistan način, smanjenjem ekspresije reporterskog gena za 40-50%. U ovaj
odgovor uključeni su transkripcioni faktori Sp3 i KLF1.
Pokazali smo da broj i tip VNTR ponovaka u promotoru gena za TPMT utiče na nivo TPMT
transkripcije. Arhitektura VNTR regiona (konfiguracÿa i broj nukleotida izmedu A i C
ponovaka) moduliše transkripciju gena za TPMT. VNTR region može biti odgovoran za
raznolikost u aktivnosti TPMT enzima unutar tri definisane grupe metilatora.
Naši rezultati pokazuju da su VNTR genotipovi koji doprinose TPMT fenotipu slabih
„metilatora" zastupljeni u jednoj trećini srpske populacije. Zbog toga bi tandemski ponovci u
promotoru gena za TPMT mogli biti kandidat za farmakogenetički marker. Dalja istraživanja
bi potvrdila da li je ovaj region od kliničkog značaja za individuaiizaciju tiopurinske terapije.
Thiopurine S-methyltransferase (TPMT; EC 2.1.1.67) represents one of the examples of
pharmacogenetics applied for individualizing drug therapy. It is an enzyme that metabolizes
immunosuppressive thiopurine medications, used in treatment of autoimmune diseases,
cancer and in transplantation medicine. TPMT activity is polymorphic and trimodal
distribution has been demonstrated in Caucasians, namely low, intermediate and high
methylator groups. However, there is no clear separation between these patient groups. It
was shown that certain TPMT gene polymorphisms affect TPMT enzyme activity. Human
TPMT gene promoter is highly polymorphic. It contains a variable number of 3 GC-rich
tandem repeats, namely A, B and C, ranging from 3 to 9 in length, but maintaining a AnBmC
architecture.
Here, we investigated if the TPMT genotypization could be an efficient tool for guiding of
thiopurine therapy in acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients, carriers of TPMT
polymorphism. We also analyzed the promoter tandem repeat distribution of alleles and
genotypes in Serbian population. We investigated the influence of number and type of
promoter tandem repeats on transcription of human TPMT gene using transient
transfection experiments, addressed the interaction of transcription factor binding to the
VNTRs by EMSA and supershift assays, analyzed the méthylation status of VNTR region, cis-
regulatory elements in promoter region and investigated potential influence of 6-MP on
TPMT gene transcription.
Our study has confirmed that TPMT genotyping is necessary and efficient for modification of
thiopurine therapy in ALL patients, even if they are heterozygous carriers of TPMT
polymorphism.
We have detected 11 different types of VNTRs in the TPMT gene promoter in the Serbian
population. Number of repeats ranged from 4 to 8. Within the TPMT promoters containing
the same number of tandem repeats, different architecture of VNTRs has been determined,
namely AnBmC, where n ranged from 1-5 and m ranged from 1-6. We have determined 17
different TPMT VNTR genotypes in Serbian population. Functional assays revealed that
TPMT promoter with the highest activity was the one with VNTRMb type (AB2C). Promoters
with 5, 6 and 7 VNTR alleles all had successively lower activities, VNTR*8 activity was two
times higher than activity of VNTR*7 types. We found differences in activity between the
constructs containing the same number, but different type of tandem repeats. The most
prominent difference was observed between VNTR*4 variants (A2BC and AB2C). The results
of functional analysis demonstrate that the activity of TPMT promoter depends not only on
the overall number of tandem repeats but also on the type of the repeat. The 5' TPMT
promoter region from -180 to -130 is a transcriptional activator.
We have confirmed that transcription factors Sp1 and Sp3 directly bind to VNTR region.
TPMT gene promoter demonstrated a specific response to 6-MP treatment (10 pM) of the
cells in a VNTR-specific manner, namely reduction of reporter gene expression from 40-50%.
Transcription factors Sp3 and KLF1 are involved in this response.
We have shown that number and type of VNTRs in the TPMT gene promoter determine
level of TPMT transcription. VNTR architecture (distance and configuration from A to C
repeats) probably spatially and in sequence specific manner, modulate TPMT transcription.
VNTR region may be responsible for diversity in TPMT activity among defined groups of
TPMT methylators.
Our results showed that VNTR genotypes that contributed to low- methylator TPMT
phenotype, comprised one third of Serbian population. For that reason promoter tandem
repeats could be considered as candidate pharmacogenetic marker. Further investigation
will confirm if it could be of clinical importance for individualizing thiopurine therapy.
Akvatični ekosistemi su konstantno izloženi multistres uslovima, jerna njih simultano deluju različiti tipovi pritisaka - od globalnihpromena, preko hidromorfoloških izmena vodnih tela do ...zagađenjaporeklom iz koncentrisanih i rasutih izvora. Efikasnost upravljačkihmera u cilju zaštite ili unapređenja statusa akvatičnih ekosistemazavise u velikoj meri od pouzdane procene rizika i precizneidentifikacije ključnih pritisaka, što u multistres uslovima nijejednostavno. Regulatorno uslovljeni monitoring programi imaju za ciljpre svega procenu hemijskog i ekološkog statusa (potencijala) vodnihtela. Međutim, dugogodišnja iskustva pokazuju da po pravilu, ocenestatusa na osnovu ova dva ključna kriterijuma nisu saglasne, pa je teškoustanoviti jasne uzročno – posledične veze između zagađenja hazardnimsupstancama i promena na nivou akvatičnih životnih zajednica. Jednaod mogućnosti za prevazilaženje ovog problema je primenabioanalitičkih (mahom in vitro) metoda i biomarkera (kod eksponiranihjedinki i populacija) u retrospektivnoj proceni rizika kao sponeizmeđu hemijskog i biološkog monitoringa. Biomarkeri kao ranipokazatelji prisustva i / ili efekata hemijskog stresa mogu doprinetiidentifikaciji prioritenih lokacija, hazardnih supstanci i njihovihsmeša i povezati izloženost određenim klasama polutanata ilinjihovim smešama u životnoj sredini, sa efektima uočenim na višimnivoima biološke organizacije. Odabir optimalne baterijekomplementarnih opštih i specifičnih ekosistemski relevantnihbiomarkera, različitih nivoa biološke organizacije, od molekularnihdo fizioloških, primenljivih u različitim prostorno-vremenskimokvirima, i dalje predstavlja istraživački izazov i stoga je i predmetistraživanja ove doktorske disertacije. Opšti cilj istraživanja je bioodabir, optimizacija i integracija baterije fizioloških, enzimskih imolekularnih biomarkera kod riba, kao ključnog segmenta kompleksnogmultiparametarskog dijagnostičkog pristupa za identifikacijuhemijskog stresa koji predstavlja značajan pritisak na akvatičneekosisteme u realnim multistres uslovima. Specifični ciljevi suvezani za zadatke dve studije slučaja u okviru kojih je istraživanjesprovedeno. U okviru studije slučaja Novi Sad procenjeno je da jetoksični pritisak na odabranim lokalitetima nizak, ali ipak viši ugradskoj zoni Novog Sada u odnosu na uzvodne lokalitete. Na osnovuefekata uzoraka vode sa istih lokaliteta in vitro pERK1/2 esej se pokazaokao potencijalno koristan alat za monitoring efekta zagađenja uakvatičnim ekosistemima, zadovoljavajuće osetljivosti, kojom je mogućetektovati odgovor pri tretmanu kompleksnim uzorcima iz životnesredine koji sadrže jedinjenja koja utiču na ERK1/2 signalni put.Ograničenje ove metode, kao samostalnog alata predstavlja je niskaspecifičnost ERK1/2 signalnog puta na koji može uticati veliki brojsupstanci sa različitim načinima delovanja, pa se njegov potencijalogleda u primeni sa komplementarnim metodama u okviru kompleksnihbaterija in vitro bioeseja. Studija slučaja Novi Sad je u fokusu imala iunapređenje terenskih protokola i eksperimentalnih postavki kojiomogućavaju primenu biomarkera na različitim prostorno-vremenskimskalama u istražnim monitoring programima sa akcentom na velike reke,a koji podrazumevaju kavezni sistem izlaganja jedinki riba i procenuefekata hemijskog stresa kod jedinki iz prirodnih populacija.Primenom kavezne postavke izlaganja jedinki C. carpio je potvrđeno da jeza upotrebu biometrijskih parametara kao biomarkera potrebno duževreme izlaganja, dok su najosetljiviji parametri bili aktivnost enzimakatalaza, parametri imunog odgovora i autofagije kao i biomarkerineurotoksičnosti, među kojima se posebno istakao gen za bazni proteinmijelina. Zajedno sa detektovanim supstancama u serumu i mišićnomtkivu jedinki, odgovori biomarkera neurotoksičnosti su ukazali nazastupljenost ove grupe polutanata na analiziranim lokalitetima.Rezultati analize biomarkera kod jedinki riba iz prirodnih populacijaističu značaj novoidentifikovanih uloga različitih gena i proteinakoji su uobičajeno smatrani biomarkerima efekta, pokazujući da promeneu ovim parametrima ne moraju nužno ukazivati na pogoršanje zdravljajedinki riba, već bi se trebale tumačiti kao adaptivni odgovor nahemijski stres, pre nego direktan dokaz ekološkog uticaja zagađenja ine slučaja na široj prostornoj skali-tok reke Dunavizvršena je analiza efekata polutanata u prirodnim populacijama Alburnus alburnus, pri čemu nisu uočene razlike između analiziranihlokaliteta usled prirodne varijabilnosti i male veličine uzorka, kao inedostatka adekvatnog referalnog lokaliteta.
Organophosphorus insecticides have been the most applied group of
insecticides for the last two decades. Their main toxic effects are related
to irreversible inactivation of acetylcholinesterase ...(AChE). Actually, they
covalently bind to serine OH group in the enzyme active site forming
phosphorylated enzyme that cannot hydrolyze acetylcholine. Organophosphorus
insecticides in the environment undergo the natural degradation pathway
including mainly homogeneous and heterogeneous hydrolysis (especially at high
pH) generating non-inhibiting products. Additionally, thio organophosphates
are easily oxidized by naturally present oxidants and UV light, forming more
toxic and stable oxons. Thus, oxidative degradation procedures, generally
referred as advanced oxidation processes (AOP), have been applied for their
efficient removal from contaminated waters. The most applied bioassays to
monitor the organophosphate toxicity i.e. the detoxification degree during
AOP are Vibrio fischeri and AChE bioassays. Vibrio fischeri toxicity test
exploits bioluminescence as the measure of luciferase activity of this marine
bacterium, whereas AChE bioassay is based on AChE activity inhibition. Both
bioanalytical techniques are rapid (several minutes), simple, sensitive and
reproducible. Vibrio fischeri test seems to be a versatile indicator of toxic
compounds generated in AOP for organophosphorus insecticides degradation.
However, detection of neurotoxic AChE inhibitors, which can be formed in AOP
of some organophosphates, requires AChE bioassays. Therefore, AChE toxicity
test is more appropriate for monitoring the degradation processes of thio
organophosphates, because more toxic oxo organophosphates might be formed and
overlooked by Vibrio fischeri bioluminescence inhibition. In addition, during
organophosphates removal by AOP, compounds with strong genotoxic potential
may be formed, which cannot be detected by standard toxicity tests. For this
reason, determination of incidence of micronuclei and cell proliferation
index in cultivated human lymphocytes and fibroblasts is suitable for
evaluation of organophosphorus insecticides and their break down products
inducing cytogenetic damage.
nema
Organophosphorus insecticides have been the most applied group of insectcides for the last two decades. Their main toxic effects are related to irreversible inactivation of acetylcholinesterase ...(AChE). Actually, they covalently bind to serine OH group in the enzyme active site forming phosphorylated enzyme that cannot hydrolyze acetylcholine. Organophosphorus insecticides in the environment undergo the natural degradation pathway including mainly homogeneous and heterogeneous hydrolysis (especially at high pH) generating non-inhibiting products. Additionally, thio organophosphates are easily oxidized by naturally present oxidants and UV light, forming more toxic and stable oxons. Thus, oxidative degradation procedures, generally referred as advanced oxidation processes (AOP), have been applied for their efficient removal from contaminated waters. The most applied bioassays to monitor the organophosphate toxicity, i.e., the detoxification degree during AOP are Vibrio fischeri and AChE bioassays. Vibrio fischeri toxicity test exploits bioluminescence as the measure of luciferase activity of this marine bacterium, whereas AChE bioassay is based on AChE activity inhibition. Both bioanalytical techniques are rapid (several minutes), simple, sensitive and reproducible. Vibrio fischeri test seems to be a versatile indicator of toxic compounds generated in AOP for organophosphorus insecticides degradation. However, detection of neurotoxic AChE inhibitors, which can be formed inh AOP of some organophosphates, requires AChE bioassays. Therefore, AChE toxicity test is more appropriate for monitoring the degradation processes of thio organophosphates, because more toxic oxo organophosphates might be formed and overlooked by Vibrio fischeri bioluminescence inhibition. In addition, during organophosphates removal by AOP, compounds with strong genotoxic potential may be formed, which cannot be detected by standard toxicity tests. For this reason, determination of incidence of micronuclei and cell proliferation index in cultivated human lymphocytes and fibroblasts is suitable for evaluation of organophosphorus insecticides and their break down products inducing cytogenetic damage. Keywords: Organophosphorus insecticides * Acetylcholinesterase * Degradation * Advanced oxidation processes * Bioassays * Toxicity * Genotoxicity U ovoj studiji je dat pregled bioanalitickih tehnika za procenu toksicnosti i detekciju organofosfatnih insekticida i proizvoda njihove degradacije koji nastaju tokom unaprecenih procesa oksidacije za uklanjanje insekticida iz vode. Posebna paznja je posvecena acetilholinesteraznim bioesejima, koji se zasnivaju na inhibiciji enzimske aktivnosti, za detekciju neurotoksicnih jedinjenja formiranih tokom degradacije organofosfata u oksidacionim procesima za preciscavanje voda, kao i testiranju genotoksicnosti organofosfatnih insekticida i proizvoda njihove transformacije. Opisan je i mehanizam toksicnog delovanja organofosfatnih jedinjenja kao specificnih inhibitora acetilholinesteraze, enzima koji katalizuje hidrolizu neurotransmitera acetilholina u holinergickim sinapsama. Kljucne reci: organofosfatni insekticidi, acetilholinesteraza, degradacija, unapreceni procesi oksidacije, bioeseji, toksicnost, genotoksicnost. Dostupno na Internetu sa adrese ?asopisa:
Kao jedna od najstarijih grupa fotoautotrofnih mikroorganizama, cijanobakterije predstavljaju široko rasprostranjene prokariote sa raznovrsnim metaboličkim strategijama u cilju preživljavanja i ...adaptacije na različite uslove životne sredine. Upravo zbog toga, cijanobakterije su značajne kao producenti različitih biološki aktivnih metabolita. Međutim, većina studija o cijanobakterijama uglavnom je vezana za cijanobakterije vodenih ekosistema. Predmet istraživanja ovog rada je utvrđivanje diverziteta autohtonih cijanobakterija šumskih ekosistema i karakterizacija odabranih terestričnih cijanobakterijskih predstavnika planinskih područja Srbije izolovanih tokom trogodišnjeg monitoringa kroz utvrđivanje njihovih osnovnih ekofizioloških, biohemijskih i genetičkih karakteristika. Rezultati dobijeni u ovom radu su ukazali na diverzitet zemljišnih cijanobakterija šumskih staništa ispitivanih planinskih područja kao i na njihov metabolički diverzitet, odnosno potencijal produkcije različitih bioaktivnih jedinjenja. Na osnovu taksonomski važnih odlikaidentifikovano je i okarakterisano 20 cijanobakterijskih sojeva za koje je utvrđeno da pripadaju sledećim rodovima:Nostoc, Anabaena, Tolypothrix, Calothrix, Cylindrospermum, Lyngbya, Oscillatoria, Phormidium. Identifikacija izolovanih cijanobakterija primenom molekularanog markera 16S rRNK u većini slučajeva (90%) je potvrdila preliminarnu identifikaciju rodova na osnovu morfoloških kriterijuma. U pogledu produkcije biomase dobijeni rezultati su pokazali da jeprodukcija biomase kod odabranih testiranih cijanobakterijskih sojeva zavisila od primenjenih uslova kultivacije. Utvrđeno je da su azot, glukoza i saharoza delovali u pravcu stimulacije produkcije biomase kod velikog broja sojeva. Najveća produkcija biomase detektovana je kod sojaCalothrixM2 u prisustvu azota u medijumu. Kod sojaNostocT18 zabeleženo je najveće povećanje produkcije biomase u prisustvu glukoze i saharoze u medijumu. Takođe, sadržaj fikobiliproteina bio je povećan kod većine testiranih sojeva u prisustvu glukoze i saharoze u medijumu. Ispitivanjem sadržaja ugljenih hidrata (glukoze, fruktoze i ksiloze) konstatovano je prisustvo sva tri monosaharida kod svih sojeva pri čemu je svaki soj imao specifičan ugljeno-hidratni profil. Sadržaj monosaharida kod svih testiranih sojeva opadao je u sledećem redosledu glukoza ˃fruktoza ˃ ksiloza. Izuzetnu sposobnost produkcije heksoza i pentoza ispoljila su tri sojaNostocM1, PhormidiumT11 iCalothrixM2. Antibakterijska aktivnost intracelularnih ekstrakata registrovana je kod 16 testiranihcijanobakterijskih sojeva i zavisila je od kombinacije cijanobakterijski-bakterijski soj i tipa primenjenog ekstrakta. U odnosu na heksanske ekstrakte, metanolni ekstrakti su pokazali veću efikasnost, ukazujući na prirodu bioaktivnih jedinjenja sa antibakterijskim delovanjem. Najefikasnijim su se pokazali 75% MeOH ekstrakti cijanobakterijskih sojevaOscillatoriaM2, Calothrix M2,LyngbyaT7 iCylindrospermumK1 koji su ispoljili antibakterijsku aktivnost na 4 testirane bakterije. Hemijskom analizom masno kiselinskog sastava utvrđeno je da je masno kiselinski sadržaj cijanobakterijskih sojeva varirao u zavisnosti od soja. Najznačajniji konstituenti testiranih cijanobakterijskih sojeva bile su 18-to i 16-to ugljenične masne kiseline poput linolne kiseline i α-linoleinske. Najveći sadržaj linolne kiseline detektovan je kod sojeva Phormidium T11 i Tolypothrix K11 što ukazuje na sojeve kao potencijalno značajne izvore esencijalnih masnih kiselina. Antiradikalska aktivnost detektovana je kod svih testiranih cijanobakterijskih sojeva. U DPPH eseju, etanolni ekstrakti soja Calothrix M2 ispoljili su najefikasniju sposobnost „hvatanja“ DPPH·radikala dok je u slučaju FRAP metode najveću redukujuću moć imao etanolni ekstrakt soj Cylindrospermum K1. Hemijskom analizom fenolnog sastava kod analiziranih cijanobakterijskih sojeva identifikovano je i kvantifikovano ukupno 21 fenolno jedinjenje. Fenolni sastav je varirao u zavisnosti od soja, a najčešće detektovana fenolna jedinjenja bila su luteolin-7-O-glukozid, bajkalin i kemferol. Soj sa najznačajnijom sposobnošću produkcije fenolnih jedinjenja bio jePhormidiumM1 kod koga je identifikovano prisustvo 11 fenolnih jedinjenja. Testirajem toksičnosti intracelularnih ekstrakata u biotestovima A. salina, D. magna i D. rerio ukupno 40% testiranih sojeva ispoljilo je toksičan efekat. Najtoksičnijim sojem se pokazao sojNostoc T7 koji je ispoljio toksičnost u sva tri testa. U slučaju biotestaA. salinanajtoksičnijim sojevima pokazali su seNostocT7,OscillatoriaM2, OscillatoriaT18 iNostocK15. Cijanobakterijski sojevi koji su ispoljili najpotentniju aktivnost u biotestuD. magna bili su Tolypothrix K15, Nostoc T7 i Calothrix M2. U biotestu sa embrionima zebrica, soj sa najznačajnijim teratogenim efektom bio je CylindrospermumK1. U pogledu uticaja ekstrakta testiranog soja na ekspresiju gena kod model organizmaD. rerio,CylindrospermumK1 je ispoljio sposobnost modulacije bioloških procesa poput cirkadijalnog ritma kao i sposobnost produkcije jedinjenja sa estrogenim efektom. Rezultati analize toksigeničnosti testiranih cijanobakterijskih sojeva su pokazali da genimcyBimcyEkoji su uključeni u produkciju cijanotoksina mikrocistina nisu detektovani ni u jednom od testiranih sojeva. Odsustvo dva gena iz mcy genskog klastera ukazuje na to da su druga jedinjenja odgovorna za uočen toksični efekat u primenjenim biotestovima. Dobijeni rezultati ukazuju na značaj ispitivanja zemljišnih cijanobakterija, s obzirom na to da su rezultati ovog rada ukazali na velik metabolički diverzitet ispitivanih sojeva i izražen potencijal produkcije različitih bioaktivnih jedinjenja.
PDF
