Nanomaterials, due to their small dimensions and manifold physicochemical
characteristics have great potential for application in various areas of
life. One of nanoparticles with wide implementation ...in biomedicine is
fullerene C60. Its weak water solubility can be overcome by derivatization
after which fullerene acquires new characteristics, which affect its
functionality. The most famous water soluble C60 derivatives are fullerenols
(С60(ОН)n, n=2-40), which have great potential for implementation in
medicine. This potential is based on their ability to collect free radicals
occurring in oxidative stress in biological systems. However, on the other
hand, fullerenols are able to act prooxidatively under certain conditions.
Thus, it is necessary to define concentrations and conditions under which
fullerenol and its derivatives act as antioxidants, i.e. prooxidants. This
aspect is very important because of the impact of these nanoparticles to the
DNA, which largely defines their genotoxic i.e. antigenotoxic
characteristics. Besides the impact of nanoparticles’ concentration to
oxidative status, genotoxicity is also affected by physicochemical
characteristics of nanoparticles themselves: their size, shape, surface
charge, purity, solubility, surface modifications and aggregation, which are
all necessary to be precisely defined. Finally, the testing of the impact of
newly synthesized substances with potential for medical application to DNA,
represents a necessary step before the phase of clinical trials. Due to all
the above state, the primary aim of this paper was to test genotoxic i.e.
antigenotoxic characteristic of water-soluble fullerene derivative fullerenol
C60(OH)24, in two different mammalian models. The first model was an ovarian
cell culture of a Chinese hamster CHO-K1, and the other was a primary humane
lymphocyte cell culture. The paper evaluated physicochemical characteristics
of fullerenol nanoparticle C60(OH)24 in the cell culture medium with serum
under the conditions which were in accordance with the experimental
conditions in micronuclei and chromosomal 8 aberrations tests. Furthermore,
the affect of fullerenol to cell survival was tested with the aim of
determination of fullerenol subcytotoxic concentrations, necessary for
testing of fullerenol genotoxicity and antigenotoxicity. After that, the DNA
damage biomarkers incidence evaluation was performed for determination of
fullerenol genotoxicity potential. In the last segment of the paper, the
antigenotoxic potential of fullerenol was analyzed by evaluation of the same
biomarkers, in cell cultures, which were previously damaged by the known
cytostatic agent mitomycin C. The results of the analysis showed that
C60(OH)24 dimensions of 40-180nm depended on the cosolvent, and that it
crated stable nanoparticles in the cell culture medium with fetal bovine
serum. Cytotoxicity of fullerenol varied in the range of concentrations from
88.6 μM-443.2 μM. The analysis of fullerenol genotoxicity by the micronuclei
test and chromosomal aberrations test showed that fullerenol was not
genotoxic in the tested cell cultures, at given subcytotoxic concentrations
and treatment duration. Testing of antigenotoxic potential showed that
fullerenol affected the decrease of the tested DNA damage biomarkers.
Nanomaterijali zahvaljujući svojim malim dimenzijama i raznovrsnim
fizičkohemijskim osobinama imaju velik potencijal za primenu u različitim
oblastima života. Među nanočestice sa širokom upotrebom u biomedicini ubraja
se fuleren C60. Njegova slaba vodorastvorljivost može se prevazići
derivatizacijom, pri čemu fuleren stiče nova svojstva koja utiču na njegovu
funkcionalnost. Najpoznatiji vodorastvorni derivati C60 su fulerenoli
(С60(ОН)n, n=2-40), koji imaju velik potencijal za primenu u medicini. Taj
potencijal je baziran na njihovoj sposobosti da u biološkim sistemima
skupljaju slobodne radikale nastale u oksidativnom stresu. Međutim, sa druge
strane, fulerenoli imaju sposobnost da pod određenim uslovima deluju
prooksidativno. Zbog toga je neophodno definisanje koncentracija i uslova pod
kojima fulerenol i njegovi derivati deluju kao antioksidanti odnosno
prooksidanti. Taj aspekt je veoma važan zbog uticaja ovih nanočestica na DNK
i određuje u velikoj meri njihova genotoksična odnosno antigenotoksična
svojstva. Pored uticaja koncentracije nanočestica na oksidativni status, na
genotoksičnost utiču i fizičkohemijske karakteristike samih nanočestica kao
što su: veličina, oblik, površinsko naelektrisanje, čistoća, rastvorljivost,
površinske modifikacije i agregacija, koje je takođe potrebno precizno
definisati. Konačno, ispitivanje uticaja novosintentisanih supstanci sa
potencijalom za medicinsku aplikaciju na DNK, predstavlja neophodan korak pre
faze kliničkih studija. Zbog svega navedenog, primarni cilj ovog rada jeste
ispitivanje genotoksičnih odnosno antigenotoksičnih svojstava vodorastvornog
fulerenskog derivata fulerenola C60(OH)24, na dva različita sisarska modela.
Prvi model je ćelijska kultura ovarijuma kineskog hrčka CHO-K1, a drugi
primarna ćelijska kultura humanih limfocita. U radu su evaluirane
fizičkohemijske karakteristike nanočestice fulerenola C60(OH)24 u medijumu za
ćelijske kulture sa serumom i to u uslovima koji odgovaraju 6
eksperimentalnim uslovima u testovima mikronukleusa i hromozomskih aberacija.
Zatim je ispitan uticaj fulerenola na preživljavanje ćelija u cilju
utvrđivanja subcitotoksičnih koncentracija fulerenola, potrebnih za
ispitivanje genotoksičnosti i antigenotoksičnosti fulerenola. Nakon toga je
izvršena evaluacija incidencije biomarkera oštećenja DNK radi utvrđivanja
genotoksičnog potencijala fulerenola. U poslednjem segmentu rada je
evaluacijom istih biomarkera analiziran i antigenotoksičan potencijal
fulerenola, na ćelijskim kulturama koje su prethodno oštećene poznatim
citostatskim agensom mitomicinom C. Rezultati analiza su pokazali da je
C60(OH)24 dimenzija od 40-180 nm u zavisnosti od kosolventa, kao i da gradi
stabilne nanočestice u medijumu za ćelijsku kulturu sa fetalnim goveđim
serumom. Citotoksičnost fulerenola kreće se u opsegu koncentracija od 88,6
μM-443,2 μM. Analizom genotoksičnosti fulerenola testom mikronukleusa i
hromozomskih aberacija pokazano je da fulerenol nije bio genotoksičan u
ispitivanim ćelijskim kulturama, pri ispitivanim subcitotoksičnim
koncentracijama i pri datim vremenskim tretmanima. Ispitivanje
antigenotoksičnog potencijala je pokazalo da fulerenol utiče na snižavanje
ispitivanih biomarkera oštećenja DNK.
The objectives of these investigations were to investigate primary DNA damage
in isolated human lymphocytes exposed to adrenaline and ephedrine. DNA damage
was evaluated by the in vitro Comet assay. ...A broad spectrum of adrenaline and
ephedrine concentrations (range from 0.0005 μM to 300 μM) were examined in
the Comet assay for various treatment times (15 min, 60 min, 120 min, 240 min
and 24 h). The most profound DNA damage was observed after 15 min of
adrenaline treatment, as all concentrations tested except the lowest one
(0.0005 μM) caused an increase in DNA migration. After 1 h, 2 h and 4 h of
treatment, adrenaline induced DNA damage at concentration range from 5 μM to
300 μM. The slightest DNA damage was observed after 24 h of adrenaline
treatment, therefore only the highest concentrations of adrenaline (150 μM
and 300 μM) caused increased level of DNA damage. In order to evaluate the
potential contribution of reactive oxygen species (ROS)-induced DNA damage
exposed to adrenaline, we used antoxidants catalase (100 IU and 500 IU) and
quercetin (100 μM and 500 μM). Co-treatment of lymphocytes with adrenaline
(300 μM) and antioxidants for 15 or 60 min, significantly reduced the
quantity of DNA in the comet tails. Therefore, it can be concluded that
adrenaline exhibits genotoxic effects mainly through induction of reactive
oxygen species and that some of the DNA damage is repaired during the first
four hours following the treatment with adrenaline. Unlike adrenaline,
ephedrine did not induce increased level of DNA migration in comparison to
the negative control for various treatment times. Only the highest
concentration of ephedrine (500 μM) induced a statistically significant DNA
damage. The chosen concentrations of ephedrine (1, 50, 300 μM) were further
tested with inhibitors of DNA repair (cytosine arabinoside and hydroxyurea)
in order to evaluate the possible increase in DNA damage. Treatment with
inhibitors of DNA repair caused significant rise in DNA damage in all chosen
concentrations of ephedrine at 15 and 60 min. Since inhibitors of DNA repair
also increased level of DNA migration in the negative control, increases of
DNA damage co-treated with inhibitors of DNA repair (AraC + HU) resulted from
unrepaired endogenous DNA damage. Hence, it can be concluded that ephedrine
does not exhibit genotoxic effects in the in vitro Comet assay on human
lymphocytes.
U ovom radu cilj istraživanja je bilo ispitivanje primarnih oštećenja DNK
izolovanih limfocita čoveka pod uticajem adrenalina i efedrina. Oštećenja DNK
su evaluirana primenom in vitro Komet testa. Ispitivan je širok spektar
koncentracija adrenalina i efedrina (u rasponu od 0,0005 μM do 500 μM) u
različitim vremenskim intervalima (15 min, 60 min, 120 min, 240 min i 24
sata). Najizraženije oštećenje DNK ustanovljeno je nakon 15 min tretmana
adrenalinom, pri čemu su sve koncetracije izuzev najniže (0.0005 μM) dovele
do povećane migracije DNK. Nakon 60 min, 120 min, 240 min tretmana
adrenalinom indukovano je oštećenje DNK u opsegu od 5 do 300 μM. Najslabiji
efekat ispoljen je nakon 24 sata, tako da su samo najviše koncetracije
adrenalina (150 μM i 300 μM) dovele do povećanog stepena oštećenja DNK. Radi
utvrđivanja mogućeg učešća reaktivnih kiseoničnih vrsta (ROS) u indukovanju
DNK oštećenja pod dejstvom adrenalina upotrebili smo antiokisanse katalazu
(100 IU i 500 IU) i kvercetin (100 μM i 500 μM). Kotretman limfocita
adrenalinom (300 μM) i antioksidansima nakon 15 ili 60 minuta doveo je do
značajnog smanjenja količine DNK u repovima kometa. Prema tome, može se
zaključiti da adrenalin ispoljava svoje genotoksične efekte indukcijom
reaktivnih kiseoničnih vrsta i da se neka oštećenja poprave tokom prva četiri
sata nakon tretmana adrenalinom. Za razliku od adrenalina, efedrin nije doveo
do povećanja migracije DNK u odnosu na negativnu kontrolu tokom različitih
vremenskih intervala. Jedino je koncetracija efedrina od 500 μM nakon 15
minuta tretmana indukovala oštećenje DNK koje je bilo statistički značajno.
Odabrane koncetracije efedrina (1, 50, 300 μM) su dalje testirane u prisustvu
inhibitora reparacije (citozin arabinozid - AraC i hidroksiurea - HU) radi
ispitivanja eventualnog povećanja oštećenja DNK. Tretman sa inhibitorima
reparacije uzrokovao je značajna povećanja DNK oštećenja u svim
koncetracijama efedrina (1, 50 and 300 μM) nakon 15 i 60 min. S obzirom da su
inhibitori reparacije takođe doveli do povećane migracije DNK i kod negativne
kontrole povećana oštećenja u kotretmanu sa inhibitorima reparacije (AraC i
HU) rezultat su postojanja DNK oštećenja koja su posledica već prisutnih
endogenih oštećenja. Shodno tome, zaključuje s da efedrin ne ispoljava
genotoksične efekte u in vitro Komet testu na humanim limfocitima.
Izloženost radiofrekvencijskom elektromagnetskom polju (RF-EMF) na radnoj frekvenciji različitih komunikacijskih uređaja može imati razne biološke učinke. Nedostaju istraživanja odgovora na ...oksidacijski stres i genotoksičnost u medonosne pčele (Apis mellifera) poslije izloženosti RF-EMF-u. U ovom je radu istražen oksidacijski stres i DNA oštećenja u ličinkama medonosnih pčela smještenih u stanicama saća i izloženih modulirajućem RF-EMF 23 Vm-1. Aktivnost glutation S-transferaze smanjena je, dok je aktivnost katalaze značajno povećana u ličinkama medonosnih pčela izloženih RF-EMF-u. Nije bilo statistički značajne promjene u aktivnosti superoksid-dismutaze, razini lipidne peroksidacije i DNA oštećenju između ličinaka medonosne pčele i kontrolne skupine. Ovi rezultati pokazuju da biološki učinci modulirajućeg RF-EMF u ličinkama medonosne pčele ovise o oblikovanju izloženosti.
Novi aspekti u klasifikaciji kancerogena Foth, Heidi; Degen, Gisela H.; Bolt, Hermann M.
Arhiv za higijenu rada i toksikologiju,
05/2005, Letnik:
56, Številka:
2
Journal Article
Recenzirano
Odprti dostop
U postojećem sistemu klasifikacije kancerogenih tvari utvrđena je razlika između genotoksičnih i negenotoksičnih kemikalija. Za negenotoksične kemikallije mogu se izvesti pretpostavljeni stupnjevi ...izlaganja kod kojih ne postoji značajan rizik od pojave raka kod ljudi. Za genotoksične kancerogene mogući su na primjer inducirani kromosomski efekti bez početka procesa mutageneze, dok genotoksični toksini koji se ne vežu za DNA-molekulu, a djeluju na topoizomere ili diobeno vreteno ili su aneugeni, izazivaju kancerogene efekte jedino u visokim, toksičnim dozama. Za specifične mehanizme klastrogenog djelovanja i procesa kancerogeneze koji se baziraju na reaktivnom kisiku postoji prag početka procesa. Kako su vrste kemikalija reaktivne na kisik (ROS) u načelu genotoksične, pojavljuju se pitanja da li kemikalije koje povećavaju produkciju ROS-vrsta treba pridodati endogenim kancerogenima pozadinskog stupnja koji uzrokuju nelinearni odnos doze i učinka. Uzimajući u obzir rasprave o prisutnosti endogenih kancerogena, sada postaje jasno da se kancerogeni rizik od niskih doza mora uzeti u obzir sukladno načinu njihova djelovanja.
Štetni učinci povišenih razina katekolamina posredovani su različitim mehanizmima, uključujući transkripciju gena i formiranje produkata oksidacije. Svrha je ovoga istraživanja bila utvrditi jesu li ...molekularni mehanizmi koji stoje u osnovi štetnoga djelovanja adrenalina na DNA posredovani reaktivnim vrstama kisika (ROS). Da bismo to postigli, izložili smo humane stanice pune krvi adrenalinu (10 μmol L-1) i vodikovu peroksidu (50 μmol L-1) (pozitivna kontrola), koje su odvojeno predtretirane i post-tretirane kvercetinom (500 μmol L-1), „hvatačem“ slobodnih radikala. Kvercetin je značajno smanjio broj stanica s DNA oštećenjima i u predtretmanu i u post-tretmanu, što je sugeriralo da adrenalin djeluje uglavnom stvaranjem ROSa. Taj je mehanizam podržan i postupnim smanjenjem broja stanica s oštećenjima DNA izazvanim adrenalinom i H2O2 u vremenskim intervalima od 15, 30, 45 i 60 minuta nakon tretmana. Naši rezultati jasno pokazuju da su mehanizmi popravka prilično učinkoviti u odnosu na ROS-posredovana oštećenja DNA izazvana adrenalinom.
Svrha rada: Usporediti citotoksičnost/genotoksičnost zagrijanih kompozita polimeriziranih preko CAD/CAM overleja na kulturi izoliranih ljudskih limfocita. Materijali i postupci: Mikrohibridni (Z100, ...3M ESPE) i nanopunjeni kompozit (Filtek Supreme Ultra, 3M ESPE) zagrijani su u uređaju za zagrijavanje kompozita (Calset, AdDent Inc.) na temperaturama od 37 °C (T1), 54 °C (T2) i 68 °C (T3). Mala količina zagrijanog kompozita stavljena je u cilindrični kalup (promjera 6 mm, debljine 0.65 mm), prekrivena Mylar folijom, sprešana, te osvjetljena izravno, preko CAD/CAM keramički pojačanog polimera (CRP) (LAVA Ultimate, 3M ESPE) ili CAD/CAM litij disilikatnog keramičkog overlaja (LDC)(e.max, Ivoclar/Vivadent) debljine 2 mm. Odmah nakon osvjetljavanja uzorci su stavljeni u staničnu kulturu limfocita izoliranih iz periferne krvi. Citotoksičnost je izmjerena metodom dvojnog bojenja etidijevim bromidom i akridinskom narančastom bojom koja omogućuje određivanje postotka živih stanica te stanica u apoptozi i nekrozi na osnovi njihovih morfoloških obilježja. Genotoksičnost je procijenjena
uporabom komet-testa u alkalnim uvjetima. Rezultati: Za Z100, najveći postotak živih stanica zabilježen je na T1 (93,7 %) nakon izravnog osvjetljavanja; slijedi osvjetljavanje preko CRP-a (92,3 %) te LDC-a (91,7 % T1, T3). Za Filtek Supreme Ultra najveći postotak živih stranica zabilježen je nakon osvjetljavanja preko CRP-a (91,2 % T2), LDC-a (90 % T1, T3) te pri izravnom osvjetljavanju (88,7 % T2). Zaključak: Za oba ispitivana materijala, zagrijavanje na T1 i T2 postupak je izbora. S obzirom na genotoksičnost, ne preporučuje se zagrijavanje na T3.
Kronična izloženost niskim razinama ionizirajućega zračenja povezana je s rizikom od dugoročnih štetnih posljedica za zdravlje, što obuhvaća i mutacije gena te nastanak raka. U tijeku je potraga za ...pouzdanim biopokazateljima izloženosti ionizirajućem zračenju u ljudi, budući da njihova primjena može značajno unaprijediti praćenje profesionalno izloženih osoba. U tom smislu, a s obzirom na ranija saznanja, cilj je ovoga istraživanja bio utvrditi mutacije gena za proizvodnju humanoga interferona alfa-2b (hIFNα-2b gena) kao mogućega biopokazatelja profesionalne kronične izloženosti niskim dozama ionizirajućega zračenja, koje je usto povezano s djelovanjem na hematopoezu i pad imuniteta. Analiziran je genomski DNA 51 rudara u rudnicima uranija te 38 kontrolnih ispitanika iz Kazahstana, odnosno genomski DNA 21 zdravstvenoga radnika na radiologiji i 21 kontrolnoga ispitanika iz Italije. Mutacije hIFNα-2b gena utvrđivane su metodom lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu (engl. real-time PCR) odnosno sekvenciranjem prema Sangeru, ali se pokazalo da niti jedan radnik nije imao niti jednu od deset traženih mutacija toga gena. Stoga ne preostaje drugo nego i dalje tražiti pouzdane biopokazatelje za rano otkrivanje štetnih zdravstvenih učinaka povezanih s kroničnom izloženosti niskim dozama ionizirajućega zračenja.
Cilj istraživanja je proširiti znanje o štetnim učincima nanočestica procjenom genotoksičnosti, kao ocjenom rizika za okoliš, kod mozambičke tilapije Oreochromis mossambicus. Ribe su bile izložene ...subletalnim koncentracijama odabranih nanočestica kao što su silicijev dioksid (SiO2NPs-12mg/L), aluminij oksid (Al2O3NPs-4 mg/L), titanijev dioksid (TiO2NPs-16.4 mg/L) i željezni oksid (Fe3O4NPs- 15 mg/L) u kratkotrajnim (24, 72 i 96 h) i dugotrajnim vremenskim rasponima (15, 30 i 60 dana). Genetska oštećenja, kao što su citoplazmatska, nuklearna i oštećenja DNK, izmjerena su u eritrocitima riba korištenjem standardnih testova genotoksičnosti - mikronukleus i komet test. Učestalost mikronukleusa, zajedno s nuklearnim i citoplazmatskim abnormalnostima, zabilježena je i uspoređena s kontrolnom skupinom. U ovisnosti o vremenu, kod svih izloženih skupina, pri usporedbi s kontrolom, utvrđen je značajno povišen intenzitet mikronukleusa (p<0,05) zajedno s ostalim nuklearnim i citoplazmatskim anomalijama, što ukazuje na kromosomske oštećenja kao posljedica kontakta s nanočesticama. Također, ovisno o vremenu, duljina i postotak repa DNK unutar kometa značajno se povećala (p<0,05) nakon izlaganja svim nanočesticama, što ukazuje povećanje oštećenja DNK. U konačnici, koristeći mikronukleus i komet test, očito je da odabrane nanočestice u subletalnim koncentracijama izazivaju genetska oštećenja kod Oreochromis mossambicus.
U ovom istraživanju gujavice vrste Eisenia fetida bile su izložene elektromagnetskom polju (EMP) na frekvenciji mobilnih telefona (900 MHz) te poljima jačine 10 do 120 V m-1 u dvosatnom razdoblju ...(što odgovara specifičnim ratama apsorpcije od 0,13 do 9,33 mW kg-1). Utjecaj dužeg izlaganja (4 sata), modulacije polja te vrijeme oporavka od 24 sata nakon dva sata izlaganja proučavan je pri jačini polja od 23 V m-1. Metoda kvantitativne nasumično umnožene polimorfne DNA (engl. quantitative random amplified polymorphic DNA – qRAPD) otkrila je značajne modifikacije DNA na svim proučavanim tretmanima. Čak i nakon 24-satnog oporavka broj hibridizacijskih mjesta bio je dvostruko manji u odnosu na broj zabilježen u kontrolnim gujavicama, što upozorava na gubitak hibridizacijskih mjesta i na dugoročan utjecaj EMP-a. Ekspresija gena uključenih u odgovor na stres (HSP70: kodira za 70kDa heat shock protein i MEKK1: uključen u provođenje signala), oksidacijski stres (CAT: kodira za katalazu) te kemijsku i imunosnu obranu (LYS: kodira za lysenin i MYD: kodira za faktor mijeloidne diferencijacije) bila je povišena nakon izlaganja polju jačine 10 V m-1 te moduliranome polju jačine 23 V m-1. Western blot analiza potvrdila je odgovor na stres detekcijom povišene količine HSP70 i MTCO1 proteina. HSP70 i LYS geni imali su povišenu ekspresiju i nakon razdoblja oporavka, što upućuje na dugotrajan utjecaj EMP-a.
Izloženost alkilnim anilinima može uzrokovati rak mokraćnoga mjehura, koji je drugi po redu po učestalosti raka mokraćnospolnog sustava. 3,5-dimetilanilin često se rabi u industrijskoj proizvodnji, a ...istraživanja njegova primarnog metabolita, 3,5-dimetilaminofenola (3,5-DMAP), pokazuju da on uzrokuje oksidacijski stres i promjene u aktivnosti antioksidacijskih enzima te u konačnici dovodi do smrti raznih stanica u sisavaca. Dosad, međutim, nije provedeno nijedno istraživanje njegovih izravnih učinaka na epitelne stanice mokraćnoga mjehura i bubrega u ljudi. Za spojeve selenija smatra se da smanjuju oksidacijski stres različitih kemikalija te da dopuna prehrane selenijem smanjuje rizik od raka mokraćnoga mjehura. Primarni je cilj ovoga istraživanja bio utvrditi može li organski spoj selenija selenometionin (SM, 10 μmol/L), odnosno anorganski spoj natrijev selenit (SS, 30 nmol/L, smanjiti oksidacijski stres, oštećenje DNA i apoptozu u UROtsa stanicama izloženima 3,5-dimetilaminofenolu. Jednosatna izloženost stanica 3,5-DMAP-u dovela je do povećanja razina reaktivnih kisikovih spojeva (ROS), lipidne peroksidacije, oksidacije bjelančevina te do promjena u aktivnosti antioksidacijskih enzima u staničnoj citoplazmi i jezgri, ovisno o primijenjenoj dozi. Osim toga, komet-testom su utvrđeni
jednolančani, ali ne i dvolančani lomovi DNA. Također, 3,5-DMAP uzrokovao je apoptozu stanica. Oba su spoja selenija pružila djelomičnu zaštitu od njegova toksičnoga djelovanja. Nedostatak selenija pri izloženosti alkilnim anilinskim spojevima stoga može odigrati značajnu ulogu u nastanku raka mokraćnog mjehura. Potrebna su daljnja istraživanja mehanizama djelovanja selenija u njegovu sprječavanju.
PDF
