Het kunnen vertalen van een extracellulair signaal naar een corresponderende intracellulaire reactie is essentieel voor alle levende organismen. Het waarnemen van deze extracellulaire signalen, of ...extracellulaire signaal moleculen, gebeurt over het algemeen via ligand bindende eiwitten die over het plasma membraan heen steken, de zogenaamde receptor eiwitten. In planten vallen de meeste plasma membraan receptor eiwitten onder de familie van ‘leucine-rich-repeat receptor- like-kinases’ of LRR-RLKs. Deze eiwitten bevatten een extracellulair domein met een leucine rijk motief, gekoppeld aan een intracellulair kinase domein via een enkel trans-membraan helix. Zowel de plant LRR-RLKs als hun dierlijke tegenhangers, de receptor tyrosine kinases (RTKs)worden gedacht dimeren of oligomeren te vormen om op die wijze hun intracellulaire kinase domeinen te activeren. Soms maken ook andere transmembraan eiwitten onderdeel uit van deze receptor complexen. Wanneer dit het geval is, kunnen we onderscheid maken tussen de ‘hoofd’ receptor, die zowel het domein bevat dat het extracellulaire signaal molecuul kan herkennen, als de mogelijkheid bezit om dit signaal over het membraan heen te kunnen vertalen naar een cellulaire reactie. Daarnaast kunnen er ook nog co-receptoren onderdeel uitmaken van het receptor complex. Deze receptoren kunnen op zichzelf staand óf het signaal niet herkennen, óf dit signaal niet omzetten in een cellulaire reactie. De somatische embryogenese receptor kinases (SERKs) zijn een familie van co-receptoren in planten, die meerdere functies in zeer verschillende, en ogenschijnlijk niet gekoppelde, signaal transductie routes bewerkstelligen. Zo werken de SERKs in het vormen van sporen, de groei en ontwikkeling van de plant, en het afweermechanisme. In Arabidopsis thaliana bestaat de SERK familie uit vijf leden, waarvan alleen van SERK5 nog geen functie bekend is. De andere vier SERK leden in Arabidopsis thaliana hebben deels overlappende functies, maar elk functioneert wel in zijn eigen specifieke subset aan signaal transductie routes.In deze thesis heb ik gekeken naar de SERK familie van receptor kinases, om hun rol als co-receptoren in plant signalering en de regulatie van deze eiwitten beter te begrijpen. Door studies naar receptor functie en signalering in dierlijke systemen, weten we dat co-receptoren veel verschillende functies kunnen vervullen binnen signaal complexen, waardoor zij een additionele vorm van regulatie bewerkstelligen voor de signaal transductie. De kennis die hiervan al aanwezig is, heb ik bediscussieerd in Hoofdstuk 1. In dit hoofdstuk heb ik ook een overzicht gegeven van de huidige kristal structuren die al gepubliceerd zijn over plant LRR-RLKs. Deze structuren geven de eerste aanwijzingen over de onderliggende moleculaire mechanismen van de functie van plant receptor kinases. Interessant genoeg laten deze structuren zien dat de extracellulaire domeinen van de SERK eiwitten interacteren met niet alleen de hoofd-receptor, maar ook met de verschillende liganden. De aminozuren van SERK die deze interactie met de hoofd-receptor en het ligand aangaan zijn aanwezig in de hele familie en kunnen dus de verschillende functies van de verschillende SERK leden niet verklaren. Op dit interessante punt ga ik verder in Hoofdstuk 2. Door genetische studies is het duidelijk geworden dat de functionele verschillen tussen de SERK leden niet verklaard kan worden door verschillen in expressie, maar door verschillen op eiwit niveau. Echter, doordat de SERK-leden enorm op elkaar lijken op aminozuur niveau, is het ietwat onverwacht dat zij zulke verschillende functies vervullen in plant signalering. In Hoofdstuk 2 zoom ik verder in om te kijken welke residuen/motieven of domeinen belangrijk zijn voor de verschillende functionaliteiten binnen de SERK familie. Een vergelijking van de sequentie van SERK eiwitten van verschillende plant soorten (van mos, tot rijst en tomaat) laat zien dat de SERK genen oude genen zijn, en al met meerdere kopieën te vinden zijn in de genomen van niet-vasculaire planten (zoals Physcomitrella patens). De SERK genen uit deze evolutionair oudere genomen lijken erg op de SERK1 en 2 van Arabidopsis thaliana, wat aangeeft dat de eiwitten niet veel veranderd zijn in 2 miljoen jaar evolutie. Dit is een sterke aanwijzing dat de SERK genen essentieel zijn in belangrijke plant signaal routes. De A. thaliana SERK3 en 4 genen zijn echter wel meer veranderd in hun sequentie, en vormen een aparte groep SERK genen die alleen in tweelobbige planten aanwezig is. Hoogstwaarschijnlijk is deze verandering van de SERK3/4 genen gekoppeld aan een andere functionaliteit van deze eiwitten. Het koppelen van het extracellulair domein van een SERK aan het intracellulair domein van een andere SERK (waarmee chimere eiwitten ontstaan) laat zien dat de specificiteit tussen de verschillende SERK leden een complex geheel is, welke niet kan worden toegeschreven aan één specifiek aminozuur/motief of zelfs domein.Het vergelijken van de driedimensionale eiwit structuur van de SERK leden kan helpen bij het begrijpen van functionele specificiteit en overlap binnen deze familie. In de afgelopen jaren zijn de eerste kristal structuren van plant LRR-RLKs gepubliceerd. Dit waren het kinase domein van SERK3/BAK1, het extracellulair domein van SERK1 in complex met het extracellulair domein van BRI1 (Brassinosteroid Insensitive 1, de receptor voor het plant steroïde hormoon brassinosteroid) en het complex van het extracellulair domein van SERK3 met FLS2 (Flagellin Sensing 2, de receptor die bacterieel flagelline herkent). Deze structuren geven belangrijke informatie over de structuur-functie relatie van plant LRR-RLKs. Extra structuren, van de andere SERKs of van andere complexen, kunnen veel informatie opleveren over hoe de verschillende functionaliteiten van de SERKs gekoppeld zijn aan hun structuur. In Hoofdstuk 2 beschrijf ik onze werkwijze om de kristalstructuren van de kinase domeinen van de verschillende SERK eiwitten op te helderen. Onze aanpak werd gehinderd door lage eiwitopbrengst en moeilijkheden tijdens de zuivering. Het is gelukt om twee kristallen te groeien van het SERK1 kinase domein, welke een diffractie vertoonde van ongeveer 2.5 Å resolutie. Echter, hiermee was het niet mogelijk om de structuur te bepalen.Het vergelijken van de driedimensionale eiwit structuur van de SERK leden kan helpen bij het begrijpen van functionele specificiteit en overlap binnen deze familie. In de afgelopen jaren zijn de eerste kristal structuren van plant LRR-RLKs gepubliceerd. Dit waren het kinase domein van SERK3/BAK1, het extracellulair domein van SERK1 in complex met het extracellulair domein van BRI1 (Brassinosteroid Insensitive 1, de receptor voor het plant steroïde hormoon brassinosteroid) en het complex van het extracellulair domein van SERK3 met FLS2 (Flagellin Sensing 2, de receptor die bacterieel flagelline herkent). Deze structuren geven belangrijke informatie over de structuur-functie relatie van plant LRR-RLKs. Extra structuren, van de andere SERKs of van andere complexen, kunnen veel informatie opleveren over hoe de verschillende functionaliteiten van de SERKs gekoppeld zijn aan hun structuur. In Hoofdstuk 3 beschrijf ik onze werkwijze om de kristalstructuren van de kinase domeinen van de verschillende SERK eiwitten op te helderen. Onze aanpak werd gehinderd door lage eiwitopbrengst en moeilijkheden tijdens de zuivering. Het is gelukt om twee kristallen te groeien van het SERK1 kinase domein, welke een diffractie vertoonde van ongeveer 2.5 Å resolutie. Echter, hiermee was het niet mogelijk om de structuur te bepalen.Naast structurele informatie, kan biochemische informatie over de eiwitten ook veel duidelijkheid geven. In Hoofdstuk 4 gebruik ik een combinatie van spectroscopische technieken en activiteit assays om te onderzoeken hoe de activiteit van het kinase domein gereguleerd is. Co-receptoren hebben vaak een functie als extra regulatie van een signaal transductie route, maar kunnen dit natuurlijk alleen wanneer hun eigen activiteit ook strikt gereguleerd is. Zowel in deze thesis, als in andere studies, is het aangetoond dat veel kinase domeinen van receptoren en co-receptoren intrinsiek aan staan wanneer zij in vitro geproduceerd worden. Dit betekend dat er in vivo mechanismen moeten bestaan die het eiwit inactief houden wanneer hun activiteit niet wenselijk is. In Hoofdstuk 4 heb ik een mechanisme onderzocht wat eiwitten inactief kan houden, namelijk het houden van het eiwit in een intrinsiek wanordelijke staat. Dit betekend dat het eiwit niet de correcte structuur heeft, en ongestructureerd of ontvouwen is tot dat de activiteit nodig is. Het vouwen of structureren van het eiwit kan dan geïnduceerd worden wanneer het eiwit op de juiste locatie is, of onderdeel is van het juiste eiwitcomplex. Onze resultaten laten zien dat het SERK1 kinase domein kan hervouwen tot een actief kinase in vitro, dus zonder enige vorm van cellulaire context of interactie partners. Na 30 minuten hervouwen, is ongeveer 80% van de kinase activiteit herkregen (in vergelijking met de kinase activiteit voor het ontvouwen). Hieruit concluderen wij dat het SERK1 kinase domein niet alleen intrinsiek actief is, maar zich ook efficiënt vouwt tot een actief eiwit. Hierdoor is het onwaarschijnlijk dat intrinsiek ontvouwing een manier is waarop de fosforylatie activiteit van SERK1 geregeld is.De functie van een eiwit is nauw gekoppeld aan zijn locatie in een cel. De SERK eiwitten, aangezien zij RLKs zijn, zijn gelokaliseerd in het plasma membraan. Dit lijkt ook de belangrijkste plaats te zijn waarvandaan veel van de signaal transductie routes beginnen waarin SERKs een rol spelen. Het plasma membraan is niet homogeen en veel eiwitten ondervinden beperkingen in hun diffusie door het plasma membraan. In Hoofdstuk 5 van deze thesis is de distributie van de SERK3 co-receptor en de BRI1 hoofdreceptor op het plasma membraan te zien. Om deze distributie
İnsan normal ve tümör meme doku pirüvat kinazı saflaştırılarak moleküler ağırlığı ve kinetik özellikleri araştırılmış, normal meme dokusu ile tümör meme dokusu pirüvat kinaz aktivite düzeyleri ...karşılaştırılmıştır.
DEAE Sefadeks A-SO kromatografi ile meme dokusunda pirüvat kinazın iki farklı formunun varlığı gösterilmiştir. SDS-PAGE ile alt birimlerinin moleküler ağırlığı normal dokuda 1. pikte 30.000 Da, II. pikte 63.000 Da, tümör dokusunda ise 1. pikte 16.500 Da, II. pikte 60.000 Da olarak saptanmıştır. Pirüvat kinaz aktivitesi tümör meme dokusunda normal meme dokusuna göre 5,2 kat fazla bulunmuştur. Pirüvat kinaz enzimi normal meme dokusunda 1. pik 1591 kat, II. pik 636,4 kat, tümör dokusunda I. pik 219 kat, II. pik ise 318 kat saflaştırılabilmiştir.
Reaksiyon hız eğrisi normal ve tümör meme dokusu pirüvat kinazının 1. pikinde hiperbolikti ve FDP tarafından aktive edilmemiştir. II. pikte reaksiyon hız eğrisi tümör meme dokusunda hiperbolik, normal meme dokusunda ise sigmoidaldır ve FDP tarafından aktive edilmiştir. Hill katsayısı PEP için enzimde en az iki bağlanma bölgesinin varlığını göstermiştir.
İnsan meme dokusundan izole edilen pirüvat kinaz izoenzimleri diğer doku pirüvat kinaz izoenzimleri ile karşılaştırıldığında bunların M, ve M2 izoenzim olduğu ve normal meme dokusundaki M2 izoenzimin tümör meme dokusunda K izoenzime dönüşebileceği düşünülebilir.
The molecular weight and kinetic properties of pyruvate kinase purified from human normal and tumor breast tissues were studied and the activity levels of pyruvate kinase from normal and tumor breast tissues were compared.
The presence of 2 forms of pyruvate kinase in human breast tissue was demonstrated by DEAE Sephadex A-50 chromatography. The molecular weight of subunits estimated by SDS-PAGE in forms I. and II. in normal breast tissue and in forms I. and II. in tumor breast tissue were 30,000 and 63,000 Da and 16,500 and 60,000 Da, respectively. It was found that the pyruvate kinase activity in tumor tissue was 5.2 times higher than that in normal tissue. Peaks I and II of pyruvate kinase were able to be purified about 1591-fold and 636.4-fold in normal breast tissue, and 219-fold and 318-fold in tumor breast tissue, respectively.
The reaction rate curve was hyperbolic in the first peaks of both normal and tumor breast tissue pyruvate kinase and was not activated by fructose-1, 6-diphosphate (FDP). Reaction rate curves in the second peaks of tumor breast tissue and normal breast tissue pyruvate kinase were hyperbolic and sigmoidal, respectively, and were activated by FDP. The Hill coefficient showed that there were at least 2 binding regions in the enzyme for PEP.
When compared with other tissue pyruvate kinase isozymes, it seems likely that the isoenzymes of pyruvate kinase isolated from human breast tissue were M, and M2 isozymes and that the M2 isozyme of pyruvate kinase from normal breast tissue changed into K isoenzyme in tumor breast tissue.
Amaç: Preeklampsi ve gestasyonel hipertansiyonda kardiak troponin-T, kreatin fosfokinaz (CK-MB) ve miyoglobin değerleri normal gebelerdeki değerlerle karşılaştırılarak preeklampside minör ...miyokardiyal hasar araştırıldı.Gereç ve Yöntemler: Çalışmaya 3 grup dahil edildi: 74 gebeden oluşan kontrol grubu (grup I), 61 gebeden oluşan sadece antihipertansif tedavi alan grup (grup II), antihipertansif ve antikonvulzan (MgSO4) tedavisi alan 20 kişilik grup (grup III). Oluşturulan üç grup yaş, parite, troponin-T, CK-MB, miyoglobin açısından karşılaştırıldı. Diastolik kan basıncı, anormal karaciğer fonksiyonları ve proteinüri varlığı ile ortalama troponin-T, myoglobin ve CK-MB değerleri arasındaki ilişki araştırıldı. İstatistiksel analizlerde ki-kare testi, Mann-Whitney U ve Kruskal-Wallis testi kullanıldı. p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.Bulgular: Kardiak troponin-T grup III'te en yüksek olmak üzere hasta gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı yüksek bulundu. Ciddi preeklampsi kriterlerinden olan diastolik kan basıncının ³110mmHg olması ve anormal karaciğer fonksiyonları ile kardiak troponin-T düzeyleri arasında anlamlı ilişki olduğu görüldü, CK-MB ve miyoglobin değerleri açısından anlamlı ilişki saptanmadı. Sonuç: Minör kardiyak hasarın en iyi göstergesi olan troponin-T'nin preeklamptik gebelerde yüksek bulunması, gebelikte hipertansif hastalıklarla ilişkili kardiak miyofibriler hasarı düşündürtmektedir.
Objective: To evaluate minor myocardial injury in preeclampsia and gestational hypertension by serum markers of cardiac troponin-T, creatine phosphokinase (CK-MB iso-enzyme), myoglobine.Material and Methods: Group I consisted of 74 uncomplicated pregnancies; Group II consisted of 61 pregnancies taking antihypertensive theraphy; Group III consisted of 20 patients who were administered both antihypertensive and anticonvulsive (MgSO4) theraphy. The groups were compared for maternal age, parity, mean troponin-T, CK-MB and myoglobine values. To clarify the relationship between the mentioned serum markers and diastolic blood pressure, abnormal liver functions, proteinuria, the groups were compared. In statistical analyses Chi-square test, Mann Whitney-U, Kruskal-Wallis test were used, where appropriate. Significance was set at p<0.05.Results: Cardiac troponin-T levels were statistically significantly higher in group II and III than in group I. Cardiac troponin levels were significantly higher in patients with abnormal liver functions and diastolic blood pressure above 110 mmHg. No statistically significant difference was found with mean levels of CK-MB and myoglobine levels.Conclusion: Higher values of troponin-T in preeclamptic patients is thought to be a result of myocardial injury associated with pregnancy-induced hypertension.
PDF
