DIKUL - logo
Fakulteta za farmacijo, Ljubljana (FFALJ)
  • Priprava rdečega fluorescenčnega proteina z N-končnim imunoglobulin-vezavnim peptidom = Preparation of a red fluorescent protein with the N-terminal immunoglobulin-binding peptide : University Study Programme Cosmetology
    Jašovič, Vita
    V celični in molekularni biologiji pogosto uporabljamo poročevalne proteine, s katerimi označujemo strukture v celicah ali tkivih. Gre pravzaprav za fluorokrome, pri katerih je ob osvetljevanju ... značilen pojav fluorescence, ko molekula absorbira svetlobo določene valovne dolžine in nato izseva svetlobo nižje energije, torej daljše valovne dolžine. Za označevanje celičnih struktur s poročevalnimi proteini moramo običajno v organizem vnesti njihov genski zapis. Rdeči fluorescenčni protein (RFP) v vzbujenem stanju fluorescira rdeče-oranžno, z maksimalnim vzbujanjem pri 558 nm ter emisijskim maksimumom pri 583 nm. Zaradi globljega prodiranja rdeče svetlobe skozi tkiva te fluorescenčne proteine uporabljamo pri mikroskopiji debelejših tkivnih vzorcev. V okviru diplomske naloge smo kot poročevalski protein uporabili RFP in mu na N-konec pripeli imunoglobulin-vezavni peptid min19Fc_Q6D z aminokislinskim zaporedjem GSYWYDVWF. Peptidi bi lahko postali alternativa bakterijskim imunoglobulin-vezavnim proteinom, ki jih uporabljamo kot specifične ligande protiteles (npr. pri afinitetni kromatografiji za čiščenje monoklonskih protiteles iz procesne tekočine), saj imajo le-ti številne prednosti. Z afinitetnim ligandom min19Fc_Q6D, ki izkazuje afniteto do regije Fc protiteles IgG, smo tvorili fuzijski protein min19Fc_Q6D-RFP, pri katerem smo lahko zaradi poročevalnega proteina z UV-detekcijo spremljali njegovo izražanje ter skušali vezavo na IgG vrednotiti s fluorescenčnoimunskim testom (FLISA). Gen za fuzijski protein smo pripravili z verižno reakcijo s polimerazo in ga vstavili v ekspresijski vektor. Rekombinantni protein smo uspešno izrazili v bakteriji Escherichia coli NiCo21. V nadaljevanju smo ga s pomočjo kovinsko-kelatne afinitetne kromatografije ter nadaljnjega razsoljevanja z gelsko izključitveno kromatografijo ustrezno očistili, izolirali ter ga pripravili za vrednotenje vezave na regijo Fc protiteles IgG. Interakcije s protitelesi nismo uspeli potrditi. Možne razlage za to so: i) RFP sterično ovira interakcijo med peptidom min19Fc_Q6D in protitelesi, ii) interakcija termodinamsko ni ugodna zaradi znižanja entropije, do katere bi prišlo ob vezavi, ali iii) test FLISA ni dovolj občutljiv, saj signal izhaja zgolj iz monosloja molekul na dnu vdolbinic mikrotitrske ploščice.
    Vrsta gradiva - diplomsko delo ; neleposlovje za odrasle
    Založništvo in izdelava - Ljubljana : [V. Jašovič], 2020
    Jezik - slovenski
    COBISS.SI-ID - 27494403

    Povezava(-e):

    https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=119189

Signatura – lokacija, inventarna št. ... Status izvoda Rezervacija
Knjižnica
UNK 577.2 JAŠOVIČ VITA Priprava 0000000205
IN: 0016680 Knjižnica
UNK 577.2 JAŠOVIČ VITA Priprava 205
IN: 0016680 		prosto - za čitalnico
loading ...
loading ...
loading ...

Vnos na polico